生物信息学笔记（三）：基因定量

为什么要对进行基因定量

转录组数据分析中，一个转录本反转录后的cDNA会被打碎成片段测序并和基因组比对，就会导致长转录本在给定的cDNA长度下可能会映射更多的cDNA，也就是说基因长度会影响Reads数。
测序深度是指测序过程中每个碱基被测序的平均次数，其计算公式为：$\frac{Reads数*Read长度}{参考序列长度}$：例如，对长100bp的目标区域进行捕获测序：采用单端测序，每个read长5bp；总共得到了200个reads；把所有的reads比对到目标区域后，100bp的目标区域中有98bp的位置至少有1个read覆盖到，换言之，剩余的2bp没有1个read覆盖。则测序深度为 200 x 5 / 100 = 10 我们说这此测序的深度为10X。显而易见，若测序越深，则对于相同长度的转录本，测序所得的Reads数更多。
综上所述，测序深度、基因长度和Reads数相关，所以需要在最终基因表达计数中去除相应的影响。注意，在基因定量的过程中，可能会由于样本本身的原因，如某个基因Reads数过高，导致基因定量后其他基因的表达量低于实际情况，这也是基因定量过程中需要去考虑的。

Raw count

所谓Raw count，又称为count数，和上一部分所说的Reads数是同一概念，是指和参考序列比对上的序列数目。原始的读取计数矩阵使用Raw count作为基础，但由于不同基因的长度和测序深度存在差异，因此无法直接比较。为了消除技术偏差的影响并赋予后续差异分析以统计学意义，需要对这些基因计数矩阵进行标准化处理，将其转化为相对值。
但注意，我们进行基因定量时需要充分考虑测序技术和原理，如在 10x 基因组学基因表达检测中，每个转录本都标有作为唯一分子标识符（unique molecular identifier，UMI）的序列。这些 UMI 能够准确定量基因表达水平，因为我们可以分辨出哪些读段是从同一个 mRNA 分子中产生的。因此，Cell Ranger 和 Space Ranger 执行 UMI 计数（不是读取计数）以测量基因表达水平，并且所有二次分析步骤都基于 UMI 计数执行。在传统的RNA-seq数据中，完整的转录本被片段化，然后进行cDNA合成、末端修复和衔接连接。在此工作流程中，从长转录本中采样片段的概率高于从短转录本中采样的概率。因此，按转录本长度（例如，TPM、RPKM、FPKM）对读取计数进行归一化是有意义的。然而，在 10x 基因表达测定中，这种基因长度偏差并不存在。因此，不建议按基因长度对UMI计数进行归一化。

RPKM/FPKM

RPKM (Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads)：每千个碱基的转录每百万映射读取的reads数，是针对单端测序的基因定量方法；FPKM (Fragment Per Kilobase of transcript, per Million mapped reads)：每千碱基片段每百万映射读取的 reads 数，是针对双端测序的基因定量方法。
以RPKM为例，其操作方法为：

计算样本中的总读数，然后将该数字除以 1,000,000——这是“每百万”比例因子；
将读取计数除以“每百万”比例因子。这针对测序深度进行了归一化，得到每百万次读数（reads per million，RPM）；
将 RPM 值除以基因的长度，以千碱基为单位，得到RPKM。

在第二代测序过程中，常采用一种方法将DNA分子打碎成片段（fragment），然后进行测序。在单末端测序中，每个片段对应一个读取序列（Read），而在双末端测序中，每个片段将从两个端点分别进行测序。因此，这两个成对的读取序列对应于同一个片段（虽然偶尔会出现只有一个读取序列与某个片段相对应的情况，这是由于某些原因导致另一个读取序列被排除或丢失了）。在这一点上存在着区别，对于FPKM（每百万片段计数）这一测量指标而言，与同一片段相关联的两个读取序列只被计算为一个读取序列。换句话说，FPKM是基于片段计数，而不是基于读取序列数量计算的，其他计算方法完全相同。
两者计算公式如下：

$FPKM = \frac{Read\quad counts}{Mapped\quad reads(Millions)\quad \times \quad Transcript\quad length(KB)}$ $RPKM = \frac{Read\quad counts(Fragments)}{Mapped\quad reads(Millions)\quad \times \quad Transcript\quad length(KB)}$

TPM

TPM（Transcripts Per Million）是一种常用的基因表达量归一化方法，它将基因的表达量调整为每百万条转录本的数量。TPM 值考虑了基因的长度和测序深度，通过将每个基因的 Counts 值除以其长度，并进行适当的归一化，将基因的表达量转换为每百万转录本数，以便进行样本间的比较和分析。TPM 值消除了样本间测序深度的差异和基因长度的影响，实质上，TPM相当于重新标准化的文库，保证每个样本中所有TPM的总和是相同的。TPM 与 RPKM 和 FPKM 非常相似。唯一的区别是操作顺序。以下是计算 TPM 的方法：

将读取计数除以每个基因的长度（以千碱基为单位），得到每千碱基读数（reads per kilobase，RPK）；
计算样本中的所有 RPK 值的和，并将此数字除以 1,000,000，得到如前的“每百万”比例因子；
将 RPK 值除以“每百万”比例因子，得到TPM。

综上，在计算TPM时，和前述指标唯一的区别是你首先对基因长度进行归一化，然后对测序深度进行归一化。然而，这种差异的影响是相当深远的。
使用 TPM 时，每个示例中所有 TPM 的总和是相同的。这样可以更容易地比较每个样品中映射到基因的reads比例。相比之下，使用RPKM和FPKM，每个样本中归一化读数的总和可能不同，这使得直接比较样本变得更加困难，在某种意义上，TPM降低了样本本身的影响，从而让样本具有可比性，即TPM实际上改进了RPKM/FPKM方法在跨样品间定量的不准确性。
其计算公式如下：

$TPM = 10^6 \times \frac{\frac {Read\quad counts}{Transcript \quad length(KB)}}{\Sigma \frac {Read\quad counts}{Transcript \quad length(KB)}}$

适用范围

如前所述，基于测序计数选择基因定量的方案，如对于10×测序，直接使用原始Count即可；
对于传统的二代测序，应当进行标准化基因定量：
1. RPKM和FPKM已经不推荐使用（参考：Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples；comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis）；
2. TPM、DESeq适合组间比较，有研究更推荐DESeq进行组间比较（comprehensive evaluation of normalization methods for Illumina high-throughput RNA sequencing data analysis；TPM, FPKM, or Normalized Counts? A Comparative Study of Quantification Measures for the Analysis of RNA-seq Data from the NCI Patient-Derived Models Repository）。